domingo, 18 de marzo de 2012
viernes, 16 de marzo de 2012
4.4 REPLICACION IN VITRO DEL ADN (PCR)
Gracias a la PCR un
fragmento de ADN se puede replicar “in vitro” de forma muy rápida. Para esta técnica se requiere:
- sintetizar los “iniciadores”: son pequeños segmentos monocatenarios de ADN complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de ADN que se quiere replicar; esto requiere conocer la secuencia de nucleótidos de ese fragmento
- la presencia de una ADN-POLIMERASA que resista temperaturas de 100ºC; ésta se obtiene a partir de una bacteria que vive en aguas termales
Para la reacción, se introducen en una disolución que contiene la enzima ADNPOLIMERASA, el fragmento de ADN a replicar, se añaden los nucleótidos que forman parte del ADN y los “iniciadores” sintetizados. Esta disolución se introduce en un aparato que varía la temperatura en ciclos: primero sube la T a 100ºC para que se separen las cadenas del fragmento de ADN (desnaturalización); a continuación, baja la T para permitir que los” iniciadores“ se unan a cada cadena de ADN, y para que la ADN-POLIMERASA añada nuevos nucleótidos a cada “iniciador”; se forman así 2 fragmentos de ADN idénticos al inicial (replicación).
A continuación, se inicia otro ciclo: sube la T a 100ºC, produciéndose la desnaturalización de los fragmentos obtenidos; baja la T y se produce la replicación de cada cadena, lo que origina 4 nuevos fragmentos de ADN. Al repetirse otro ciclo, se originarán 8 fragmentos de ADN y así sucesivamente. Cada ciclo dura unos 5´y con unos 20 a 30 ciclos se dispone de suficientes copias del fragmento inicial.
- sintetizar los “iniciadores”: son pequeños segmentos monocatenarios de ADN complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de ADN que se quiere replicar; esto requiere conocer la secuencia de nucleótidos de ese fragmento
- la presencia de una ADN-POLIMERASA que resista temperaturas de 100ºC; ésta se obtiene a partir de una bacteria que vive en aguas termales
Para la reacción, se introducen en una disolución que contiene la enzima ADNPOLIMERASA, el fragmento de ADN a replicar, se añaden los nucleótidos que forman parte del ADN y los “iniciadores” sintetizados. Esta disolución se introduce en un aparato que varía la temperatura en ciclos: primero sube la T a 100ºC para que se separen las cadenas del fragmento de ADN (desnaturalización); a continuación, baja la T para permitir que los” iniciadores“ se unan a cada cadena de ADN, y para que la ADN-POLIMERASA añada nuevos nucleótidos a cada “iniciador”; se forman así 2 fragmentos de ADN idénticos al inicial (replicación).
A continuación, se inicia otro ciclo: sube la T a 100ºC, produciéndose la desnaturalización de los fragmentos obtenidos; baja la T y se produce la replicación de cada cadena, lo que origina 4 nuevos fragmentos de ADN. Al repetirse otro ciclo, se originarán 8 fragmentos de ADN y así sucesivamente. Cada ciclo dura unos 5´y con unos 20 a 30 ciclos se dispone de suficientes copias del fragmento inicial.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) es una técnica de laboratorio que permite la copia in vitro de
secuencias específicas de DNA y que ha revolucionado el campo de la Biología
Molecular. Conceptualmente, la PCR es una técnica sencilla, consiste en la
separación por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere amplificar, y su
copia simultánea a partir de un punto, determinado por un fragmento de DNA
artificial llamado cebador, mediante la acción de una enzima denominada DNA
polimerasa. El resultado es la duplicación del número de moléculas de una
secuencia concreta de DNA. Este proceso se repite un número determinado de
veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificación
exponencial del número de copias del fragmento de DNA molde. Por tanto, si
partimos de una molécula única de DNA en la muestra inicial, y en cada ciclo se
duplica el número de moléculas, teóricamente, al final de los 30 ciclos, se
obtendrán 230 moléculas idénticas, es decir 1073741824 moléculas.
La gran
ventaja de la PCR es que amplifica únicamente el fragmento de DNA que queremos
aunque esté en cantidades mínimas (alta sensibilidad) o en presencia de
grandes cantidades de otros DNA semejantes (alta especificidad). La
reacción es eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas,
en presencia de otros componentes.
La PCR
mejoró vertiginosamente como herramienta de laboratorio a partir de 1988,
gracias a dos hechos que hicieron que la técnica se pudiera automatizar: el
primero de ellos fue la comercialización de la enzima denominada Taq
polimerasa (Saiki et al, 1988) que es un enzima termoestable, por lo que
permanece activa después de incubaciones prolongadas a 94 ºC, y no hay que
añadirla en cada ciclo de amplificación. El segundo hecho fue la aparición en
el mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de
temperatura automáticamente, sin necesidad de distintos baños. La gran
revolución que ha producido en la Biología Molecular la aparición de la PCR ha
supuesto para su descubridor la concesión del Premio Nobel en el año 1993.
Así, la
PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos
como la investigación (clonado de genes, detección de clones recombinantes,
estudio de DNA de fósiles), medicina forense y criminalística (determinación
de la paternidad, identificación de individuos, identificación
sospechoso/evidencia en casos de asesinato, violación, etc.), sanidad animal
y mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas, pureza
de razas, etc.) y medicina (diagnóstico de enfermedades). La PCR fue
desarrollada por Kary Mullis (Saiki et al, 1985; Mullis, 1990) en
1985, utilizando como DNA polimerasa el fragmento Klenow de la DNA polimerasa
I de E. coli y lo llevó a cabo cambiando los tubos de reacción en cada
ciclo, entre dos baños que estaban a 94 ºC (desnaturalización) y 37 ºC
(hibridación y extensión del cebador). Debido a que esta enzima se
desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 ºC, era necesario añadirla en
cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalización, lo que convertía a
la PCR en una técnica tediosa y costosa.
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BIBLIOGRAFIA
http://www.elergonomista.com/biologiaselectividad/sb26.html
bioserv.fiu.edu/~biolab/.../dna%20processes.htm
4.4.1 SECUENCIACION DEL ADN
Consiste en determinar el orden exacto de los pares de bases en un segmento de ADN.
El ADN consta de una cadena lineal compuesta por cuatro bases que se representan con las letras: G, A, T y C. El orden en que estas bases se disponen es lo que codifica la información fundamental en el material genético de un organismo.
La secuenciación de ADN es el proceso por el cual se establece el orden preciso de bases a lo largo de una cadena de ADN. Esto se hace comúnmente al someter los fragmentos de ADN a electroforesis en gel, lo cual lleva a la separación del ADN en fragmentos que difieren en tamaño sólo por una base. Cada fragmento de ADN se detecta debido a la presencia de un marcador radioactivo o fluorescente. Los instrumentos usados más comúnmente para establecer las secuencias del ADN emplean ahora un rayo láser para detectar el ADN marcado fluorescente. A partir del patrón de los fragmentos de ADN resultantes se puede deducir la secuencia subyacente del ADN.
El ADN consta de una cadena lineal compuesta por cuatro bases que se representan con las letras: G, A, T y C. El orden en que estas bases se disponen es lo que codifica la información fundamental en el material genético de un organismo.
La secuenciación de ADN es el proceso por el cual se establece el orden preciso de bases a lo largo de una cadena de ADN. Esto se hace comúnmente al someter los fragmentos de ADN a electroforesis en gel, lo cual lleva a la separación del ADN en fragmentos que difieren en tamaño sólo por una base. Cada fragmento de ADN se detecta debido a la presencia de un marcador radioactivo o fluorescente. Los instrumentos usados más comúnmente para establecer las secuencias del ADN emplean ahora un rayo láser para detectar el ADN marcado fluorescente. A partir del patrón de los fragmentos de ADN resultantes se puede deducir la secuencia subyacente del ADN.
La introducción de métodos rápidos de
secuenciación a finales de los años 70 representó un cambio importante en los
estudios sobre el DNA Existen TRES métodos de secuenciación de los ácidos
nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos químicos a fin de
cortar el DNA a nivel de bases específicas. El otro se denomina enzimático, de
terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). Y actualmente el
metodod automatizado con lectores laser de capilaridad. El fin de ambos es
conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un
fragmento de ácido nucleico.
En
el método químico
un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por
acción de la enzima polinucleótido quinasa. Ambos extremos se separan por la
acción de una enzima de restriccion. El paso siguiente consiste en romper estos
fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas
específicas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alícuotas y
trataremos cada una de ellas con un compuesto químico que modifique una de las
cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de DNA. El tratamiento
posterior con piperidina producirá la rotura de la cadena allí donde la base
había sido alterada.
Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger
Para obtener la
secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático
de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:
El ADN molde o segmento de
ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN,
previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay
que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar en estado de hélice
sencilla.
Un enzima que replique el ADN, normalmente
la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea
como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de
las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o
"primer".
Un cebador o "primer" que suele
ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario
para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3'
OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del
fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de
nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un
"primer" con secuencia complementaria al vector empleado para
clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del
vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia
se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.
Los cuatro nucleótidos
trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente
el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato
en cada reacción.
Por último, se
necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos
didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la
posición 3' de la desoxirribosa.
La principal
diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método
automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En
el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo
habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido
trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite
automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs
de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción.
La segunda
diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La
detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a
cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN
de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel,
permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden
determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.
La
secuenciación de ADN se ha convertido en la técnica de referencia para
el diagnóstico genético de enfermedades. Inicialmente, la secuenciación
de ADN se utilizaba solamente como herramienta de investigación. De esta
manera, el uso masivo de estas técnicas permitió describir los primeros
genomas completos. Esos primeros genomas se han utilizado como
secuencias de referencia.
Hoy en dia, la secuenciación de ADN se emplea como rutina como herremienta para el diagnóstico de las enfermedades genéticas.
B IBLIOGRAFIA
http://medicina-genomica.blogspot.mx/2011/04/que-es-la-secuenciacion-de-adn.html
http://www.conocimientosweb.net/portal/term1573.html
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